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洁净实验室主要实验器材

洁净实验室材料:实验用土样。器材和仪器:试管、三角烧瓶、吸管、洗耳球、无菌涂棒、酒精灯、接种环、棉线、棉花、牛皮纸等。试剂:牛肉膏、蛋白陈、苯酚、KHPO4、KH2PO)、MgSO4、FeSO4、琼脂。培养基:①牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3g,蛋白陈10g,NaC5g,琼脂15~20g,水100oL,pH7.0-7-5;②药物培养基:将一定苯酚加入到牛肉音蛋白胨培养基中制成;③苯酚浓度梯度平板:在无菌培养皿中,先倒入7-10mL

含0.1gL苯酚牛肉膏蛋白胨培养基,将培养皿一侧置于木条上,使培养皿中培养基倾斜成斜面,且刚好完全覆盖培养皿底部;待培养基凝固后,将培养皿放平,再倒人7-10mL牛肉膏蛋白胨培养基;④以苯酚为单一碳源的液体培养基NHACI1.0g,K2HPO-0.6g、KH2PO-0.6g、MgSO0.06g、FeSO.3mg,苯酚按照设计量添加,水1000mL,pH7.0-7.5。

实验过程如下

(1)苯酚耐受菌株初步筛选

①浓度梯度培养基平板制备:按照培养基苯酚浓度梯度平板的方法制成苯浓度梯度平板。

②样品菌悬液制备:将采集到的实验用土样溶解于无菌水中,摇匀,作适度稀释后备用。

③平板涂布:用mL移液管分别从各菌悬液中取菌悬液0.2mL于苯酚梯度平板上,用涂棒涂布均匀。

④培养:恒温培养箱内30℃培养1-24时间。

⑤挑取菌落:由于在培养基平板中,药物浓度呈由低到高浓度梯度分布,平板上长成菌落也呈现由密集到稀的梯度分布,高浓度药物的生长少数菌落

具有较强的抗药性,挑取高含药区的单个菌落于牛肉膏蛋白陈培养基斜面上到线。

⑥培养、保藏:将接种后的斜面于恒温培养箱中30℃培养1-24时间,编号4℃冰箱内保藏。

以苯酚为单一碳源菌株筛选实验

①第一碳源培养基配制:按照以苯酚为单一碳源的液体培养基配制方法,用250mL三角瓶,每瓶装50mL,制成以苯酚为单一碳源的液体摇瓶;

②苯酚浓度:苯酚浓度分别按照0.2g/L,0.4gL,0.6gL,08gL,1.0gL,1.2gL六个浓度梯度配制

③平行样品:每个菌株和药物浓度各配制平行样品两瓶;

④灭菌:121℃,20min;

⑤接种:将初选的苯酚耐受性菌株,分別用少量无菌水稀释,接种于对应摇瓶中;

⑥培养:八层纱布盖口,回旋式摇床内摇振,30℃,100rmin培养2天;

检测:使用分光光度计测定OD值,以空白培养基作为对照,检测各个摇瓶内菌体浓度;

③筛选:淘不能利用苯酚为碳源菌株。菌体浓度高的样品为生长状态良好菌株,即为以苯酚为单一碳源菌株,可进行下一步实验。

(3)高耐受性苯酚降解菌筛选

①药物培养基平板配制:按照不同浓度(02eL,O4gL,06gL,0.8gL,1.0gL,1.2gL)苯酚配制药物培养基平板.

②灭菌、倒平板:121℃,20min灭菌,倒平板,各菌株、各浓度配制样品2个

③菌悬液制备:将初选的培养液进行适度稀释,或将保藏的经单一碳源实验的菌株用无菌水配制成菌悬液;

④涂平板:用1mL移液管分别从各菌悬液试管中取菌悬液0.2mL涂布于药物培养基平板上,每一个试管菌悬液涂布一组不同浓度的苯酚药物培养基平板,每个浓度设平板2个,六组共计12个;

⑤培养:恒温培养箱30℃培养1-2d;

⑥筛选、观察、记录并挑选高浓度药物培养基平板上生长旺盛菌落,此即为高耐受性苯酚降解菌,接种于牛肉膏蛋白陈培养基斜,保藏于4℃冰箱内。



资料来源:广州特耐苏净化设备有限公司 http://www.gdzhtc.com
日期:2019-07-04 人气:264
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